HGVS
Warianty genetyczne są oznaczane według zasad Human Genome Variation Society (HGVS). „C” odnosi się do sekwencji kodującej, natomiast „P” do sekwencji białkowej – zawsze w odniesieniu do określonego identyfikatora transkryptu.

HET – HETEROZYGOTA
Termin ten oznacza obecność określonego wariantu w jednej kopii genu. U heterozygot występują dwie różne wersje (allele) tego samego genu.

HETEROZYGOTA ZŁOŻONA
Dotyczy sytuacji, w której dana osoba posiada dwa odmienne warianty genu, przy czym każdy z nich znajduje się na innym chromosomie.

HOM – HOMOZYGOTA
Homozygota to organizm mający ten sam wariant w obu kopiach genu. Charakteryzuje się posiadaniem dwóch identycznych alleli.

HEM – HEMIZYGOTA
Hemizygota oznacza obecność danego wariantu w jednej kopii genu znajdującego się na chromosomie X. Pojęcie to odnosi się wyłącznie do mężczyzn, gdyż posiadają oni tylko jeden chromosom X. U kobiet natomiast występują dwie kopie tego chromosomu.

Dziedziczenie autosomalne recesywne
Choroby dziedziczone w sposób autosomalny recesywny ujawniają się, gdy w obu kopiach danego genu obecne są warianty patogenne.

Dziedziczenie autosomalne dominujące
W tym przypadku wystarczy, że jedna kopia genu zawiera wariant patogenny, aby doszło do manifestacji choroby.

Klasyfikacja patogenności wariantów
Ocena patogenności wykrytych wariantów opiera się na kryteriach ustalonych przez ACMG/AMP (American College of Medical Genetics and Genomics / Association for Molecular Pathology, NIH – National Institutes of Health, USA) oraz zgodnie z wytycznymi organizacji ClinGen (The Clinical Genome, NIH – National Institutes of Health, USA) i ACGS (The Association for Clinical Genomic Science, UK).

Technika sekwencjonowania całego eksomu (WES) oparta na sekwencjonowaniu następnej generacji (NGS) nie jest dedykowana do wykrywania:

·         dynamicznych zmian w genomie,

·         mozaikowatości somatycznych,

·         mutacji w obszarach nieuwzględnionych w zastosowanym panelu,

·         zmian strukturalnych, takich jak translokacje, inwersje oraz zrównoważone zmiany liczby kopii.

Obecność sekwencji homologicznych, w tym pseudogenów, może wpływać na zmniejszenie czułości wykrywania zmian w tych obszarach.

Identyfikacja wariantów liczby kopii (CNV) odbywa się za pomocą oprogramowania ExomeDepth, przy zastosowaniu minimum trzech próbek referencyjnych o współczynniku korelacji >0,97. Technologia WES umożliwia wykrywanie delecji oraz duplikacji obejmujących głównie całe geny w obrębie zastosowanego panelu (Illumina CEX v1.2). Nie jest jednak wystarczająco czuła i precyzyjna w detekcji zmian liczby kopii pojedynczych eksonów. Minimalna wartość współczynnika Bayes Factor (BF) wynosi >2, a jego ocena uwzględnia rozmiar i jakość wykrytej zmiany CNV zgodnie z przyjętymi kryteriami progowymi.

Proces analizy

DNA izolowano przy użyciu zestawu Xtreme DNA Kit (Isohelix, UK). Do analizy wykorzystano biblioteki Illumina DNA Prep with Enrichment (Illumina, USA) oraz rozszerzony panel całoeksomowy Diagmol WESEXT, bazujący na Illumina Exome Panel v1.2 (CEX), który obejmuje dodatkowe, istotne regiony genomowe. Panel pokrywa ponad 99,6% patogennych i prawdopodobnie patogennych wariantów znajdujących się w bazie ClinVar (National Institutes of Health, USA). Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie Illumina NovaSeq 6000.

Analizy bioinformatyczne przeprowadzono zgodnie z zaleceniami GATK (A Genomic Analysis Toolkit; The Broad Institute of MIT and Harvard, USA). Warianty filtrowano według:

Variant Quality Score Recalibration (VQSR) – czułość 99,9% dla SNP i 99,0% dla wariantów typu indel,

kryteriów twardych, obejmujących:

proporcję alleli ≥20%,

minimalne pokrycie danej pozycji ≥10× (wymagające potwierdzenia ortogonalnego),

optymalne pokrycie ≥20×,

jakość genotypu ≥20.

Warianty w rejonach homopolimerowych identyfikowano na podstawie wytycznych Global Alliance for Genomics and Health (GA4GH) Benchmarking Team oraz Genome in a Bottle, przy czym zastosowano restrykcyjne filtry opracowane i zweryfikowane w Diagmol. Analizy charakteryzują się wysoką czułością i specyficznością, osiągając F-score >99% dla zmian typu SNP oraz indel.

Dodatkowo przeprowadzono analizę z wykorzystaniem oprogramowania CE-IVD eVAI v 3.7 (engenome)

Zakres badania

Badanie obejmowało:

·         identyfikację patogennych i prawdopodobnie patogennych wariantów pojedynczych nukleotydów (SNV – single nucleotide variant) w ramach panelu genowego WES,

·         wykrywanie zmian liczby kopii (CNV) pozwalających na analizę strukturalnych nieprawidłowości w większych fragmentach genomu (np. delecji i duplikacji),

·         detekcję delecji eksonu 7 w genie SMN1, przy użyciu dedykowanego algorytmu do analizy wyników NGS w kontekście zmian liczby kopii genów SMN1 i SMN2, co umożliwia ocenę statusu nosicielstwa mutacji związanych z rdzeniowym zanikiem mięśni (SMA).